CRISPR
CRISPR | |
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CRISPR + fragmentos de ADN de E.Coli. | |
Identificadores | |
Organismo | E.Coli |
Símbolo | ? |
Otros datos |
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/5f/CRISPR_espa%C3%B1ol.png/500px-CRISPR_espa%C3%B1ol.png)
CRISPR (en inglés: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, en español: repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas[2]) es una familia de secuencias de ADN que se encuentran en el genoma de los organismos procariotas. Las secuencias contienen fragmentos de ADN de virus que han infectado a bacterias y arqueas en el pasado. Estos fragmentos de ADN son utilizados por la célula procariota para detectar y destruir el ADN de nuevos ataques de virus similares, y así poder defenderse eficazmente de ellos. Estas secuencias juegan un papel clave en los sistemas de defensa bacterianos y forman la base de una tecnología conocida como CRISPR/Cas, que es capaz de modificar los genes de cualquier organismo utilizando una familia de enzimas con actividad endonucleasa asociadas a CRISPR conocidas como Cas, tal como la Cas9 del sistema CRISPR/Cas9.
En términos más técnicos, los arreglos CRISPR son loci de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases. Tras cada repetición siguen segmentos cortos de "ADN espaciador" proveniente de exposiciones previas a un virus.[3] Se encuentran en aproximadamente el 40% de los genomas bacterianos y en el 90% de los genomas secuenciados de las arqueas.[4][5] Con frecuencia se hallan asociados con los genes cas que codifican para proteínas nucleasas conocidas como Cas relacionadas con los CRISPR. El sistema CRISPR/Cas es un sistema inmunitario procariótico que confiere resistencia a agentes externos como plásmidos y bacteriófagos[6][7] y provee una forma de inmunidad adquirida. Los espaciadores de los CRISPR reconocen secuencias específicas y guían a las nucleasas Cas para cortar y degradar esos elementos génicos exógenos de una manera análoga al ARNi en sistemas eucarióticos.[3]
Desde 2013 el sistema CRISPR/Cas se ha utilizado para la edición de genes (agregando, interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes específicos) y para la regulación génica en varias especies.[8] Al administrar la proteína Cas9 y los ARN guía apropiados a una célula, el genoma de esta puede cortarse en los lugares deseados, cuyas secuencias serán complementarias a las de los ARN guía utilizados. Esto permite la eliminación funcional de genes o la introducción de mutaciones (tras la reparación del corte realizado por la maquinaria celular de reparación del ADN) para estudiar sus efectos. Modificaciones recientes del sistema CRISPR/Cas9 permiten también actuar sobre la transcripción de los genes, modificando así solo su nivel de funcionamiento, pero no la información genética. Los investigadores plantean que los CRISPRs quizás puedan usarse para construir sistemas de entrega de genes guiados por ARN que lleguen a alterar los genomas de poblaciones enteras.[9]
Antecedentes
Las bacterias pueden incorporar ADN externo en otras circunstancias e incluso pueden tomar ADN dañado de su medio.[10]
Las secuencias repetidas que luego se conocerían como CRISPR fueron identificadas por primera vez por un grupo de científicos japoneses en 1987 (Yoshizumi Ishino et al).[11][12] y luego más tarde de forma independiente por el científico Francisco J. M. Mojica (Universidad de Alicante) a principios de los años 90 en una arquea Haloferax mediterranei y los resultados fueron publicados en 1993,[13] tras haber sido anteriormente descritas en bacterias (Escherichia coli[12] y Mycobacterium bovis[14]). Inicialmente fueron utilizadas para el tipado de bacterias, para diferenciar distintos aislados, cepas y especies.[15] Estudios iniciales por Francisco J. M. Mojica y colaboradores postularon el posible papel de estas secuencias en la partición de replicones.[16] En el año 2000, Francisco J. M. Mojica y colaboradores detectaron un gran número de estas secuencias repetidas en bacterias, arqueas y mitocondrias y propusieron el nombre de Short Regularly Spaced Repeats (SRSR, en castellano "Repeticiones Cortas Regularmente Espaciadas".[17] Pocos años después, Francisco J. M. Mojica propuso y acuñó el acrónimo CRISPR (del inglés: Clustered Regularly Interspaced Short Palyndromic Repeats), propuesta que quedó recogida en una publicación de microbiólogos holandeses en 2002[18] y que sería utilizada universalmente desde entonces para referirse a estas secuencias. También, en la misma publicación, se describió por vez primera un conjunto de genes, algunos de los cuales codifican nucleasas o helicasas putativas, asociados a las secuencias repetidas CRISPR (los genes cas o asociados a CRISPR: del inglés: CRISPR associated).[18]
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/b3/SimpleCRISPR.jpg/220px-SimpleCRISPR.jpg)
En 2005, tres grupos de investigación independientes mostraron que algunos de los espaciadores de los CRISPRs se derivan de diversas fuentes de ADN como ADN de fagos y ADN extracromosomal como los plásmidos.[19][20] Nuevamente fue el grupo de Francisco J. Mojica quien primero se dio cuenta de que las secuencias CRISPR y los espaciadores asociados podían formar parte de algún sistema inmune propio de estos microorganismos procarióticos, quien primero estableció la relación entre CRISPR e inmunidad.[21] Esas observaciones clave indican que el sistema CRISPR/cas puede tener un rol en la inmunidad adaptativa en las bacterias.[1] Koonin y sus asociados[22] propusieron que los espaciadores sirven como plantilla para moléculas de ARN, análogo a un sistema que usan los eucariontes llamado interferencia por ARN.
En 2007 Barrangou, Horvath (científicos de la industria alimenticia en Danisco) y el grupo de Moineau en la Université Laval (Canadá) mostraron que podían alterar la resistencia de Streptococcus thermophilus a ataques de fagos con ADN espaciador.[22]
Cas9
Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier, ganadoras del Premio Nobel de Química 2020, junto con Francisco Juan Martínez Mojica, habían estado explorando de manera independiente a las proteínas asociadas a CRISPR para aprender cómo las bacterias utilizan a los espaciadores en sus sistemas inmunes. Juntos estudiaron un sistema CRISPR más simple que se basa en una proteína llamada Cas9. Encontraron que las bacterias responden ante un fago invasor al transcribir espaciadores y ADN palindrómico en una larga molécula de ARN y que entonces la célula utilizaba un ARN llamado Trans-activating crRNA (tracrRNA) y también Cas9 para cortarla en pedazos llamados ARNcr.[22]
Cas9 es una nucleasa, una enzima especializada en cortar ADN, con dos sitios de corte activos (HNH y RuvC), uno para cada hebra de la doble hélice. El equipo demostró que podrían desactivar uno o ambos sitios preservando la habilidad de Cas9 de ser específico para su ADN objetivo. Jinek combinó al tracrRNA y ARN espaciador para formar una molécula llamada single-guide RNA que, al combinarse con Cas9, podía encontrar y cortar los blancos correctos de ADN. Jinek propuso que estos ARN guía sintéticos podrían usarse para la edición de genes.[22]
La primera vez que se mostró que CRISPR funcionaba como una herramienta de ingeniería genética en cultivos de células humanas fue en 2012.[23][24] Desde entonces se ha utilizado en muchos organismos, incluida la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae),[25] el pez cebra (Danio rerio),[26] la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster),[27] nematodos (Caenorhabditis elegans)[28] plantas[29] y ratones,[30] entre otros.
Adicionalmente, CRISPR ha sido modificada para hacer factores de transcripción programables que permiten a los científicos silenciar o activar ciertos genes.[31]
Existen ahora librerías con decenas de miles de ARN guía.[22]
La primera evidencia de que CRISPR puede revertir síntomas de enfermedad en organismos vivos fue demostrada en marzo de 2014, cuando investigadores del MIT curaron a ratones de desórdenes genéticos del hígado.[32]
Cas12a (anteriormente Cpf1)
En 2015, la nucleasa Cpf1 se descubrió en el sistema CRISPR/Cpf1 de la bacteria Francisella novicida.[33][34] Cpf1 mostró varias diferencias claves de Cas9 incluyendo: causando un corte 'escalonado' en el ADN de doble hebra, en oposición al corte 'brusco' producido por Cas9, basándose en un PAM rico en T (proporcionando sitios de orientación alternativos a Cas9) y requiriendo solamente Un CRISPR ARN (CRRNA) para el éxito de la orientación. Por el contrario Cas9 requiere tanto crARN y un crARN trans activado (tracrRNA)).
Actualmente esta nucleasa recibe el nombre de Cas12a, y presenta algunas variantes en función del organismo de origen, entre las que se encuentran AsCas12a (presente en la bacteria Acidaminococcus), y LbCas12a (presente en Lachnospiraceae bacterium). Además, en esta última variante se descubrió una mutación puntual, D156R, que representa la sustitución del aminoácido ácido aspártico por arginina en la posición 156 de la proteína. Cas12aD156R muestra un aumento en la eficiencia de corte en el modelo vegetal Arabidopsis thaliana, similar al que después se corroboró en D. melanogaster, generando una eficiencia en la tasa de edición génica próxima a la observada en Cas9.[35]
CasΦ
Se trata de una nucleasa hipercompacta descrita en 2020 que representa la mitad del peso molecular de Cas9/Cas12 y con características similares en su utilización como herramienta para la edición génica.[36] Además, se ha adaptado de forma exitosa a la edición in vivo en Drosophila melanogaster de forma precisa sin generar cortes en el ADN de doble cadena.[37]
Predecesores para edición génica
Al inicio de la década de los 2000, investigadores desarrollaron las nucleasas con dedos de zinc, proteínas sintéticas cuyas regiones de unión a ADN les permitían cortar el ADN en puntos específicos. Después, las nucleasas sintéticas llamadas TALENs dieron una vía más sencilla para llegar a ADN específico y se predijo que sobrepasarían a las de los dedos de zinc. Ambas dependen de la elaboración de proteínas específicas para cada ADN objetivo, un procedimiento bastante más complicado que los ARN guía. Los CRISPRs son más eficientes y pueden llegar a más genes que ambas técnicas.[38]
Primera edición génica comunicada en julio de 2017
El 12 de julio de 2017 la revista británica Nature comunicó un trabajo recibido el 22 de agosto de 2016, comunicando que investigadores de la Universidad de Harvard modificaron en el genoma de un grupo de bacterias, por medio de corta-pega o copipasteo genético logrado con la técnica CRISPR, la información digital de una fotografía y un GIF o animación corta. Después secuenciaron el ADN de los microorganismos para recuperar la imagen y el video con una precisión del 90%.[39] El avance atrajo nuevo interés científico en el campo de la ‘grabación molecular’ y en particular conjeturas, al parecer prematuras e inexactas, sobre la memorización en sistemas accedidos desde un psiquismo.
Estructura del locus
Repeticiones y espaciadores
Los loci de CRISPR van de 24 a 48 pares de bases.[40] Las repeticiones están separadas por espaciadores de longitud similar.[40] Algunas secuencias espaciadoras de CRISPR son complementarias a las de los plásmidos y fagos,[19][21][20] aunque algunos espaciadores se complementan con el genoma procarionte (espaciadores autoreplicativos).[19][41] Pueden añadirse rápidamente espaciadores nuevos como respuesta a una infección por un fago.[42]
Genes cas y subtipos de CRISPR
Los genes asociados a CRISPR, llamados cas, son genes frecuentemente relacionados con los arreglos de repeticiones CRISPR. Análisis extensivos de genómica comparativa han identificado a muchos genes cas diferentes; un análisis inicial de 40 genomas de bacterias y arqueas sugirió que podría haber 45 familias de genes cas, con solo dos genes, cas1 y cas2, siendo omnipresentes.[40] El sistema actual de clasificación de CRISPR agrupa a los operones en cas en tres grupos mayores, cada uno con múltiples subdivisiones basadas en filogenia de cas1 y en el complemento del operón del gen cas.[43] Aparte de cas1 y cas2, las tres divisiones mayores tienen conjuntos muy diferentes de genes constitutivos, con cada una de las divisiones conteniendo un ‘gen característico’ encontrado exclusivamente en esa subdivisión. Muchos organismos contienen múltiples sistemas CRISPR-Cas sugiriendo que son compatibles e incluso podrían compartir elementos.[44] La distribución esporádica de los subtipos de CRISPR/Cas sugiere que el sistema está sujeto a la transferencia genética horizontal durante la evolución microbiana.
Tipo Cas | Gen característico | Función | Referencia |
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I | Cas3 | Nucleasa para ADN de cadena sencilla. Helicasa dependiente de ATP | [45] |
IA | Cas8a | Subunidad del módulo de interferencia | [46] |
IB | Cas8b | ||
IC | Cas8c | ||
ID | Cas10d | Contiene un dominio homólogo al dominio de las polimerasas de ácidos nucleicos y ciclasas de nucleótidos | [43][47] |
IE | Cse1 | ||
IF | Csy1 | Indeterminado | |
II | Cas9 | Las nucleasas RuvC and HNH, juntas, producen cortes en cadena doble, y de manera separada pueden producir cortes en cadena sencilla | [48] |
IIA | Csn2 | Indeterminado | |
IIB | Cas4 | Indeterminado | |
IIC | Caracterizado por la ausencia ya sea de Csn2 o Cas4 | [49] | |
III | Cas10 | Homólogo de Cas10d y Cse1 | [47] |
IIIA | Csm2 | Indeterminado | |
IIIB | Cmr5 | Indeterminado |
Mecanismo
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/1c/The_Stages_of_CRISPR_immunity.svg/500px-The_Stages_of_CRISPR_immunity.svg.png)
Adquisición de los espaciadores dentro de los loci de los CRISPR
Capturar al ADN invasor e integrarlo en un locus CRISPR en forma de un espaciador es la primera etapa en la respuesta inmune. La prevalencia de cas1 y cas2 fue la primera pista de que estaban involucrados en la adquisición de los espaciadores ya que todos los CRISPRs comparten la estructura repetitiva regular. Estudios de mutaciones confirmaron esta hipótesis ya que al remover cas1 o cas2 impedía la adquisición de espaciadores, sin afectar la respuesta inmune CRISPR en sí.[46][50][51][52][53] La función exacta de Cas1 y Cas2 se desconoce, sin embargo un número de proteínas Cas1 se han caracterizado bioquímicamente y se han resuelto sus estructuras.[54][55][56] Las proteínas Cas1 tienen secuencias de aminoácidos muy diversas, sin embargo sus estructuras cristalinas son sorprendentemente similares y todas las cas1 purificadas son nucleasas dependientes de metales que se unen a ADN en modo independiente de secuencia.[44] Las proteínas Cas2 representativas también han sido caracterizadas y poseen actividad específica de endorribonucleasa ya sea para ARN de cadena sencilla o ADN de cadena doble[57][58][59] Los datos funcionales y estudios de mutación genética sugieren que Cas1 y Cas2 cortan fragmentos de ADN invasor y los insertan en arreglos CRISPR.
El análisis bioinformático de regiones de genomas de fagos que fueron cortados como espaciadores (denominados protoespaciadores) reveló que estos no estaban distribuidos aleatoriamente sino más bien se encontraban adyacentes a secuencias cortas de ADN (de 3 a 5 pb) llamadas PAMs (protospacer adjacent motifs en inglés).[60] El análisis de los sistemas CRISPR-Cas de las tres divisiones mayores han mostrado que los PAMs son importantes para los sistemas tipo I y II, pero no para el III durante el proceso de adquisición de espaciadores.[20][61][62][60][63][64] En sistemas tipo I y II, los protoespaciadores se cortan en posiciones adyacentes a una secuencia PAM, con el otro extremo del espaciador siendo cortado con un mecanismo tipo regla inherente a la proteína Cas1, manteniendo así la regularidad en tamaño de los espaciadores a lo largo del arreglo de CRISPR.[65][66] La conservación de la secuencia PAM difiere entre los sistemas CRISPR-Cas y parece estar ligada evolutivamente a cas1 y a la secuencia líder.[64][67]
Los nuevos espaciadores se añaden a un arreglo de CRISPR en un modo direccional,[19] ocurriendo preferencialmente[61][62][68][42][69] pero no exclusivamente, en forma adyacente[63][66] a la secuencia líder. El análisis del sistema tipo I-E de E. coli ha demostrado que la primera repetición directa, adyacente a la secuencia líder, es copiado, con el espaciador recientemente adquirido siendo insertado entre la primera y segunda repeticiones directas.[52][65] La secuencia PAM también parece ser importante durante la inserción de espaciadores de sistemas tipo I-E. La secuencia PAM del sistema I-E contiene un nucleótido final fuertemente conservado (adyacente al primer nucleótido del protoespaciador) y se ha mostrado que este nucleótido se convierte en la base final en la primera repetición directa.[53][70][71] Esto sugiere que la maquinaria de adquisición de espaciadores genera overhangs de cadena sencilla en la penúltima posición de la repetición directay en el PAM durante la inserción del espaciador. Sin embargo no todos los sistemas CRISPR-Cas parecen tener este mecanismo ya que los PAMs caracterizados en otros organismos no muestran el mismo nivel de conservación en la posición final.[67] Es probable que en esos sistemas, un extremo romo es generado al final de la repetición directa y el protoespaciador durante la adquisición. Análisis reciente de CRISPRs de Sulfolobus solfataricus han revelado más complejidades al modelo canónico de la inserción de espaciadores ya que uno de sus seis locus insertó espaciadores de manera aleatoria a lo largo de su arreglo CRISPR, opuesto a una inserción más cercana a la secuencia líder.[66]
Ha sido notado en una cantidad de CRISPRs que estos contienen muchos espaciadores para el mismo fago. El mecanismo que causa este fenómeno ha sido dilucidado recientemente en el sistema tipo I-E de E. coli. Una mejora significativa en la adquisición de espaciadores ha sido detectada donde ya hay espaciadores con el fago como objetivo inclusive con "desajustes" al protoespaciador. Este ‘cebado’ requiere que tanto las proteínas Cas involucradas en adquisición como en interferencia interactúen entre sí. Los espaciadores nuevamente adquiridos que resultan del mecanismo de cebado siempre se encuentran en la misma cadena que la del espaciador original que produjo el cebado.[53][70][71] Esta observación ha llevado a la hipótesis de que la maquinaria de adquisición recorre el ADN extraño después del cebado para encontrar un nuevo protoespaciador.[71]
Etapa de interferencia
La respuesta inmune por CRISPR ocurre en dos etapas: la biogénesis de CRISPR-ARN (ARNcr) y la interferencia guiada por ARNcr. Un arreglo de CRISPR es transcrito de un promotor en el líder en un solo transcrito largo.[46][72][73] Este transcrito es procesado por cortes dentro de las secuencias repetidas para formar ARNcr. Los mecanismos para producir ARNcr maduros varían de gran manera entre los tres sistemas principales de CRISPR-Cas. Tanto en sistemas del tipo I-E como I-F las proteínas Cas6e y Cas6f respectivamente, reconocen giros[74][75][76] creados por la naturaleza palindrómica de las repeticiones directas.[77] Esas proteínas cortan el transcrito primario en la unión entre los ARN de cadena sencilla y doble, dejando un extremo 5ʹ de 8 nucleótidos originado de la repetición en los ARNcr maduros y con una secuencia espaciadora. Los sistemas tipo III también usan Cas6, sin embargo, sus repeticiones no producen girosstem-loops, sino que la escisión ocurre por el "enroscamiento" del transcrito primario a lo largo de la Cas6 para permitir la división justo antes de la secuencia de repetición.[78][79][80] Los sistemas tipo II no poseen el gen Cas6 así que utilizan a la ARNsaIII para hacer los cortes. Los sistemas funcionales tipo II codifican un pequeño ARN adicional que es complementario a la secuencia de las repeticiones conocido como ARN trans-activador(tracrRNA).[50] La transcripción del tracrRNA y del transcrito primario CRISPR resulta en emparejamiento de bases y la formación de ARN de doble cadena en la secuencia de repeticiones, la cual es subsecuentemente cortada por la ARNasaIII para producir ARNcr. A diferencia de los otros dos sistemas el ARNcr no contiene el espaciador completo, está truncado en un extremo por diez nucleótidos.[48]
Los ARNcr se asocian con las proteínas Cas para formar complejos de ribonucleótidos que reconocen ácidos nucleicos extraños. Experimentos con fagos y plásmidos han indicado que los ARNcr no tienen preferencia por cadenas codificantes o no codificantes, lo cual indica un sistema específico para ADN guiado por ARN.[7][46][53][81][82][83][84] El complejo tipo I-E (llamado Cascade de forma común) requiere cinco proteínas Cas arregladas en una configuración que recuerda a un caballo de mar, unidas al ARNcr de cadena sencilla que está unido a lo largo del "lomo".[85][86] Durante el estado de interferencia en los sistemas tipo I la secuencia PAM es reconocida en la cadena complementaria al ARNcr y se requiere junto con el apareamiento de ARNcr. En los sistemas tipo I, el correcto emparejamiento entre el ARNcr y los protoespaciadores señaliza un cambio conformacional en Cascade que recluta a Cas3 para la degradación del ADN.
Los sistemas de tipo II utilizan una proteína multifuncional, Cas9, para el paso de interferencia.[48] La Cas9 requiere tanto al ARNcr como al tracrRNA para funcionar y corta al ADN usando sus dominios duales de endonucleasa: HNH y RuvC. El apareamiento de bases entre el PAM y el genoma del fago también se requiere en los sistemas tipo II, sin embargo el PAM es reconocido en la misma cadena que el ARNcr (la cadena opuesta a los sistemas tipo I).
Los sistemas tipo III, como los de tipo I, requieren un complejo multiproteico para asociarse con el ARNcr. Análisis bioquímicos y estructurales de S. solfataricus y Pyrococcus furiosus han dilucidado que seis o siete proteínas cas se unen a los ARNcr, respectivamente.[87][88] Sorpredentemente, los sistemas tipo III analizados en S. solfataricus y P. furiosus son específicos para el ARNm de fagos y plásmidos,[89][88] lo cual puede hacer a esos sistemas capaces de ser específicos para genomas de fagos basados en ARN.[44] El mecanismo para distinguir ADN propio del externo durante la interferencia está dentro de los ARNcr y por lo tanto se infiere que es conservado en los 3 sistemas. Aun a través del proceso de maduración distintiva de cada uno de los tipos, todos los ARNcr contienen una secuencia espaciadora y una porción de la repetición en uno o ambos extremos. Es la secuencia parcial de repeticiones la que previene que el sistema CRISPR-Cas ataque al cromosoma ya que el apareamiento de bases más allá de la secuencia del espaciador es una señal de que pertenece a sí mismo y previene el corte de ADN en el cromosoma.[90] Las enzimas de CRISPR guiadas por ARN se clasifican como enzimas de restricción tipo V.
Proteína asociada a CRISPR | |||||||||
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![]() Estructura cristalina de una proteína asociada a CRISPR de Thermus thermophilus | |||||||||
Identificadores | |||||||||
Símbolo | CRISPR_assoc | ||||||||
Pfam | PF08798 | ||||||||
clanPfam | CL0362 | ||||||||
InterPro | IPR010179 | ||||||||
CDD | cd09727 | ||||||||
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Proteína asociada a CRISPR Cas2 | |||||||||
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![]() Estructura cristalina de la proteína hipotética tt1823 de Thermus thermophilus | |||||||||
Identificadores | |||||||||
Símbolo | CRISPR_Cas2 | ||||||||
Pfam | PF09827 | ||||||||
InterPro | IPR019199 | ||||||||
CDD | cd09638 | ||||||||
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Proteína asociada a CRISPR Cse1 | |||||||||
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Identificadores | |||||||||
Symbol | CRISPR_Cse1 | ||||||||
Pfam | PF09481 | ||||||||
InterPro | IPR013381 | ||||||||
CDD | cd09729 | ||||||||
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Proteína asociada a CRISPR Cse2 | |||||||||
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Identificadores | |||||||||
Símbolo | CRISPR_Cse2 | ||||||||
Pfam | PF09485 | ||||||||
InterPro | IPR013382 | ||||||||
CDD | cd09670 | ||||||||
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Mutaciones aleatorias
En 2017 se demostró en un estudio[91] que este tipo de ingeniería genética puede generar centenares de mutaciones aleatorias no esperadas.
Dos días después de esta publicación, la reconocida revista Science publica un artículo que pone en entredicho la veracidad de este estudio crítico.[92] Diferentes estudios anteriores muestran un alto nivel de especificidad de CRISPR.[93][94][95]
Para la comprobación de estas mutaciones aleatorias o fuera de la región diana ("off targets" en inglés) de las guías diseñadas han surgido herramientas de estudio de estas regiones de una forma automatizada como la herramienta VIVO.[96][97] VIVO es un “sistema de detección in vivo de off-targets”. Esta herramienta es un método eficiente para la detección de las zonas de edición fuera de la región diana a la cual orientamos las guías RNA del sistema de edición genómica CRISPR /Cas. Actualmente es el único método que cuenta con una observación inicialmente in vitro de los posibles off-targets de las guías con una posterior comprobación in vivo de la acción real de las guías RNA. El sistema VIVO nos permite detectar y cuantificar las regiones fuera de la diana o "target" de las nucleasas, de esta forma se busca definir que generando una guía RNA bien diseñada esta carece de off-targets o mutaciones aleatorias.
El sistema VIVO se compone de dos etapas consecutivas:
a) CIRCLEseq : es un método in vitro para la determinación de los posibles off-targets que puede generar una RNA guía en unas células determinadas. Esta etapa se basa en la localización de regiones del DNA donde pueda producir un corte la Cas9 debido a que estas regiones son complementarias a los RNA guías diseñados. Esas regiones del DNA se cortan y se anillan, dando lugar a fragmentos circulares de DNA con regiones para el corte mediado por Cas9 y otras sin región reconocida por la Cas9 que se van a degradar mediante un tratamiento con exonucleasas. Los fragmentos circulares deseados se someten a una linealización mediante el uso de la Cas9 .Los fragmentos lineales adquieren un ligando adaptador, se someten a PCR y posteriormente se analizan mediante técnicas de secuenciación. Cada una de las secuencias obtenidas corresponderá a un posible off-target de la Cas9 mediante el uso de las guías diseñadas.
b) Comprobación in vivo: a partir de los datos obtenidos mediante CIRLCE seq se comprueba que realmente se produce un corte en esas regiones del DNA mediante la Cas9 in vivo .Para ello se utiliza un tejido al que se aplica las Cas9 y se observa si las regiones predichas por CIRCLE seq realmente se cortan por las nucleasas.
Evolución, diversidad
Estudios en Streptococcus thermophilus fueron los primeros indicativos de cómo los CRISPRs mueven a la evolución de fagos y bacterias. Un espaciador CRISPR debe corresponder perfectamente a la secuencia del gen objetivo del fago. Los fagos pueden seguir infectando a sus hospederos cuando hay mutaciones puntuales en el espaciador.[90] Se siguen requerimientos similares en el PAM o la cepa seguirá siendo sensible a fagos.[62][90] El modelo básico de evolución CRISPR se explica como el modelo donde los espaciadores recientemente incorporados llevan a los fagos a mutar sus genomas creando diversidad en las poblaciones tanto de fagos y bacterias.
La evolución CRISPR ha sido estudiada usando la genómica comparativa de muchas cepas de S. thermophilus, Escherichia coli y Salmonella enterica. Un estudio de 124 cepas de S. thermophilus mostró que 26% de todos los espaciadores eran únicos y que los diferentes locus de CRISPR mostraban diferentes tasas de adquisición de espaciadores.[61] Los resultados mostraron que un locus de CRISPR particular puede evolucionar más rápidamente que otros, lo cual ayuda a establecer relaciones filogenéticas entre cepas. Un análisis similar de cepas de E. coli y S. enterica reveló que evolucionaron mucho más lentamente que S. thermophilus. Las cepas de esta última que habían divergido hace más de 250,000 años todavía contenían el mismo complemento de espaciador.[98]
La diversidad de CRISPR se estudió en múltiples comunidades ambientales usando metagenómica. El análisis de los biofilms de los drenajes ácidos de dos minas mostró que uno de los CRISPRs analizados contenía deleciones y espaciadores extensivos en comparación con el otro biofilm, lo cual sugiere una mayor actividad de fagos en una comunidad que en otra.[42] En la cavidad oral, un estudio temporal determinó que aproximadamente del 7 al 22% de los espaciadores eran compartidos en períodos en el tiempo a lo largo de 17 meses en un mismo individuo y menos del 2% de los espaciadores fueron compartidos entre diferentes individuos en cualquier período en el tiempo.[69] Del mismo ambiente, se aisló una cepa particular usando primers de PCR específicos para su CRISPR. A diferencia de los resultados generales de la presencia/ausencia de los espaciadores, los cuales mostraban diversidad significativa, este CRISPR añadió 3 espaciadores a lo largo de 17 meses,[69] lo que sugiere que incluso en un ambiente con diversidad importante de CRISPR algunos locus evolucionan lentamente. Los CRISPRs también han sido analizados desde los metagenomas producidos por el proyecto del microbioma humano.[99] Aunque la mayoría de los CRISPRs eran específicos en un sitio, algunos CRISPRs dentro del sitio eran ampliamente encontrados entre individuos. Uno de esos locus de CRISPR se originó con estudios de especies de Streptococcus y contuvieron ~15,000 espaciadores, 50% de los cuales eran únicos. De modo similar a los estudios dirigidos de la cavidad oral, algunos de los CRISPRs mostraron poca evolución entre períodos en el tiempo.[99]
La evolución CRISPR ha sido estudiada en quimiostatos usando S. thermophilus para examinar de manera explícita la tasa de adquisición de espaciadores. En el período de una semana, cepas de S. thermophilus adquirieron hasta tres espaciadores cuando eran expuestos ante solo un fago.[100] En el mismo periodo de tiempo, el fago desarrolló varios SNPs que se quedaron fijos es la población, lo que sugiere que CRISPR había prevenido la replicación de todos los otros tipos de fagos sin estas mutaciones.[100] Otros experimentos, también con S. thermophilus, mostraron que los fagos pueden infectar y replicarse en hospederos que tienen solo un espaciador y que los hospederos sensibles existen en ambientes con altas concentraciones de fagos.[101] Los estudios por quimiostatos y observaciones en los CRISPRs sugieren muchas consecuencias al resultado de la evolución de CRISPR y fagos.
Identificación bioinformática de los CRISPR en genomas y metagenomas
Los CRISPRs están altamente distribuidos entre bacterias y arqueas[43] y muestran similitudes en las secuencias,[77] sin embargo su característica principal son sus espaciadores repetidos y repeticiones directas. Esta característica hace a los CRISPRs fáciles de identificar en largas secuencias de ADN, ya que el número de copias repetidas disminuye la posibilidad de una unión tipo falso positivo. En la actualidad hay tres programas utilizados para la identificación de repeticiones CRISPR que buscan repeticiones interespaciadas en secuencias grandes: CRT,[102] PILER-CR[103] y CRISPRfinder.[104]
El análisis de los CRISPRs en los datos de metagenómica es mucho más exigente, ya que los locus de CRISPR no suelen ensamblarse debido a su naturaleza repetitiva ni por variación de cepas, lo cual confunde a los algoritmos. Mientras que hay muchos genomas de referencias disponibles, la PCR se puede utilizar para amplificar matrices CRISPR y así analizar el contenido de los espaciadores.[61][69][105][106][107] Sin embargo, este enfoque solamente dará información de CRISPRs específicamente buscados y en organismos con suficiente representación en bases de datos públicas para poder hacer el diseño de primers de PCR confiables.
El enfoque alterativo es extraer y reconstruir matrices CRISPR basándose en datos metagenómicos al azar. La identificación de los arreglos de CRISPR de lecturas metagenómias es una tarea computacionalmente más difícil, particularmente con las tecnologías de secuenciación de segunda generación (como son 454, Illumina), ya que las longitudes cortas previenen que más de dos o tres unidades repetidas se presenten en una sola lectura. La identificación de CRISPR en lecturas crudas se logra usando puramente identificación denovo[108] o al usar secuencias repetidas directas en arreglos CRISPR parcialmente ordenados[99] como herramienta para identificar repeticiones directos en lecturas individuales.
Importancia evolutiva
Un estudio bioinformático mostró que los CRISPRs son evolutivamente conservados y que se pueden aglomerar en tipos relacionados. Muchos muestran la posibilidad de una estructura secundaria conservada.[77]
A través del mecanismo CRISPR/Cas, las bacterias pueden adquirir inmunidad a ciertos fagos y por ende detener la consecuente transmisión de estos fagos. Por esta razón los CRISPR/Cas se describen como un mecanismo de herencia Lamarckiano.[109] Otros han investigado la coevolución de los genomas vitales y hospederos.[110]
Las proteínas Cas9 están altamente enriquecidas en bacterias patogénicas y comensales. La regulación mediada por CRISPR/Cas puede contribuir a la regulación de los genes endógenos bacterianos, particularmente en la interacción bacteriana con hospederos eucariontes. Por ejemplo, la proteína Cas9 de Francisella novicida usa un pequeño y único ARN asociado a CRISPR/Cas para reprimir un transcrito endógeno que codifica para una lipoproteína bacteriana que es crítica para F. novicida para reducir la respuesta del hospedero y promover la virulencia.[111]
Aplicaciones
La prueba que demostró el principio de la redirección específica del sistema CRISPR/Cas llegó en 2012[112] y fue un primer paso para la materialización de propuestas para la biotecnología derivada de CRISPR:[113]
- Inmunización artificial contra fagos por introducción de locus CRISPR en bacterias industrialmente importantes, incluyendo a esas utilizadas en la producción de comida y fermentaciones a gran escala.
- La ingeniería genética a nivel celular u organísmico al reprogramar un sistema CRISPR/Cas para lograr ingeniería del genoma guiada por ARN. Los estudios lo han demostrado tanto in vitro[23][48] como in vivo[30][114][115][116]
- Discriminación de cepas bacterianas por comparación de secuencias espaciadoras
Terapias
Editas Medicine, una start up de 43 millones de dólares, busca desarrollar tratamientos que usen CRISPR/Cas para hacer ediciones desde pares de bases específicas hasta segmentos más grandes de ADN. Algunas enfermedades heredadas como la fibrosis quística y la anemia son causadas por mutaciones de un solo par de bases; la tecnología CRISPR/Cas tiene el potencial de corregir esos errores. El gen "corregido" permanece en su lugar habitual en su cromosoma, quien contiene la forma en que la célula normalmente activa o inhibe su expresión.[117]
Después de cultivar precursores de células sanguíneas llamados hemocitoblastos de la médula ósea de un paciente, la cirugía genética con CRISPR podría corregir el gen defectuoso. Entonces las células con el genoma corregido serían reintroducidas a la médula del paciente, que ahora producirá células sanas. Reemplazar el 70% de las células defectuosas significaría tener una cura.[38] Antes de que pueda usarse clínicamente, la compañía debe poder garantizar que solo la región objetivo será afectada y debe determinar cómo entregar la terapia a las células del paciente.[117] En 2014, investigadores de la UCSF usaron a los CRISPR para crear versiones sanas de células madre de pacientes con beta-talasemia.[118] En 2020 la empresa CRISPR Therapeutics anunció que a junio de 2020, 5 pacientes con beta-talasemia, y dos pacientes con anemia falciforme, habían sido tratados exitosamente con CTX001.[119] CTX001 es una terapia en desarrollo que las empresas Vertex Pharmaceuticals y CRISPR Therapeutics tienen en desarrollo.[120] En la noticia se indicó que dos pacientes de beta-talasemia a los 5 y 15 meses después de la edición del gen que reprime la expresión del gen de la hemoglobina fetal (HbF) eran independientes de transfusiones; y que un paciente que presenta la enfermedad de células falciformes, o anemia falciforme, a los 9 meses de la edición CTX001 se presenta libre de las crisis vasooclusivas de la enfermedad.
Otras patologías que se podrían tratar con CRISPR incluyen la enfermedad de Huntington, los efectos de la vejez, esquizofrenia y autismo e inclusive la modificación de ADN en embriones vivos.[38]
Mejorar el sistema de dirección es fundamental antes de que CRISPR pueda ser utilizado en aplicaciones médicas. Los ARN guía existentes podrían trabajar sobre secuencias que difieren en algunas pares de bases de la secuencia objetivo.[22]
En 2017 dos mellizas chinas fueron modificadas genéticamente mediante CRISPR, modificando el gen CCR5, para conseguir que fueran resistentes contra el VIH, virus causante del sida que afectaba a su padre.[121][122][123]
Modelos murinos
CRISPR simplifica la creación de modelos de ratones y reduce el tiempo requerido de meses a tan solo semanas. El knockdown de genes endógenos ha sido logrado por transfección con un plásmido que contiene un área CRISPR con un espaciador, que inhibe un gen objetivo. La inyección de cigotos de ratón con Cas9 y dos ARN guía pudo lograr desactivar dos genes con el 80% de eficacia. La llamada reparación dirigida por homología involucra el uso de Cas9 para "cortar" al ADN, y así introducir nuevas partes génicas al cigoto.
Agricultura
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/8/8d/Librer%C3%ADa_de_gusano_de_la_seda_con_CRISPR_Cas.png/188px-Librer%C3%ADa_de_gusano_de_la_seda_con_CRISPR_Cas.png)
En 2014, el investigador chino Gao Caixia aplicó para patentes para la creación de una cepa de trigo que es resistente al oídio. A la cepa le faltan genes que producen proteínas que reprimen las defensas en contra del oídio. Los investigadores borraron todas las copias de los genes del genoma hexaploide del trigo. La cepa promete reducir o eliminar el gran uso de fungicidas para controlar la enfermedad. Gao usó los sistemas de edición génica transcription activator-like effector nuclease (TALENs) y CRISPR para agregar o cambiar ningún otro gen. Aún no ha habido pruebas de campo.[124][125]
Entomología
En las células diploides eucariotas los análisis de perdida de función se han realizado primariamente por siRNA. En cambio, en los últimos años la tecnología CRISPR asociada a la proteína Cas9 ha adquirido una gran importancia. El sistema CRISPR es eficiente identificando genes en la resistencia de fármacos, tumorogénesis, respuesta inmune, interacciones con patógenos e inmunoterapia para el cáncer. Un ejemplo de esto es el estudio realizado en Bombyx mori que identificó los genes relacionados con su viabilidad celular, crecimiento, interacciones huésped-patógeno y resistencia a la temperatura, caracterizando más de 6000 genes diferentes.[126]
Identificación de elementos funcionales en regiones genómicas no codificantes
Marcadores moleculares como el estado epigenético, la accesibilidad a la cromatina, la vinculación de factores de transcripción y la conservación evolutiva, se correlacionan con elementos funcionales putativos en el genoma no codificante y pueden predecir su función reguladora.[127] Sin embargo, estas predicciones superan en gran medida las regiones que carecen de características, y es difícil determinar qué características desempeñan un papel correlativo o verdaderamente causal en la función o en el fenotipo.
Los esfuerzos para determinar la causalidad se han basado en la utilización de fragmentos de ADN preseleccionados ,[128] basándose en su expresión como sustituto de la función, pero estos métodos carecen del contexto de la cromatina local y de las interacciones reguladoras más amplias. Por lo tanto, existe la necesidad de enfoques sistemáticos para cribar variantes no codificantes y determinar si y cómo afectan a los fenotipos en un contexto biológico nativo. Para ello, se diseñó un método de alto rendimiento que utilizaba una biblioteca de ARN guía en CRISPR-Cas9 para la detección genómica de locus no codificantes con el fin de identificar las regiones funcionales relacionadas con el fenotipo y la regulación de genes. En combinación con otros ensayos de todo el genoma, se demuestra el alto rendimiento de la técnica en la identificación de las regiones donde los cambios en el contexto de la cromatina y factores de transcripción que se unen a estas regiones están causalmente vinculados a la pérdida de expresión génica y un fenotipo relevante de la enfermedad.[129][130]
Un ejemplo aplicado de esta técnica es la detección de localizaciones genómicas no codificantes que modulan la resistencia a los fármacos:
El Vemurafenib inhibe las proteínas B-Raf portadoras de la mutación[131] (cambio de valina por glutamato en la posición 600), que se encuentra en el 50 al 70% de los melanomas.[132] La resistencia al vemurafenib surge en cuestión de meses en casi todos los pacientes con melanoma, y las células tumorales supervivientes muestran un aumento de la malignidad que conduce rápidamente a la letalidad.[133][134] Una criba de CRISPR a escala genómica encontró que las mutaciones de pérdida de función en los genes NF1, NF2 y CUL3 producen resistencia a vemurafenib.[135] Para explorar si las mutaciones en las regiones no codificantes, alrededor de estos tres genes, podrían afectar de manera similar a la resistencia a los fármacos, se hizo uso de tres bibliotecas de sgRNAs que mapeaban a lo largo de 100kb en las regiones 5' y 3' de las principales isoformas de cada gen. Se concluyó que las mutaciones en la región no codificante 5' del gen CUL3 alteran los entornos locales epigenéticos y la interacción con distintos factores de transcripción (yin yang 1 (YY1), zinc finger protein 263 (ZNF263), CCCTC-binding factor (CTCF), y el complejo activation-protein 1 (AP-1) formado por Jun:Fos). Estas regiones no codificantes son de alta importancia en la regulación de genes y la resistencia quimioterapéutica y farmacológica.
Funciones
Edición
Los CRISPRs pueden agregar y eliminar pares de bases en locus de ADN altamente específicos. Se han usado los CRISPRs para cortar más de cinco genes a la vez.[22]
Knockout reversible
Los "CRISPRi", análogos a los ARNi, tienen la capacidad de desactivar los genes en un modo reversible al ser específicos pero sin hacer cortes. En bacterias, la presencia es lo único que se necesita para detener la transcripción, pero en aplicaciones de mamíferos, una sección de proteína es añadida. Guía al ARN que es específico para el ADN regulatorio, que son promotores que preceden al gen de interés.[22]
Activación
La Cas9 se usó para llevar factores de transcripción sintéticos (fragmentos proteicos que encienden genes) que activaban genes humanos específicos. Esta técnica logró un fuerte efecto al dirigir múltiples constructos de CRISPR a lugares ligeramente diferentes en el promotor del gen.[22]
Los genes incluían algunos atados a enfermedades humanas, diferenciación muscular, cáncer, inflamación y de producción de hemoglobina fetal.[22]
Uso por fagos
Otro mecanismo para la defensa de las bacterias contra invasión de fagos es teniendo islas genómicas. Un subtipo de islas llamada phage-inducible chromosomal island (PICI) es cortada del cromosoma bacteriano cuando se presenta la infección por fago y puede inhibir su replicación.[136] Los mecanismos que inducen el sistema PICI y cómo PICI inhibe la replicación del fago no se tienen entendidos hasta ahora. Un estudio mostró que el fago lítico ICP1, el cual específicamente ataca al serotipo 01 de Vibrio cholerae ha adquirido un sistema CRISPR/Cas que apunta a un elemento de tipo PICI en V. cholera. El sistema tiene dos locus CRISPR y 9 genes Cas. Parece ser que es homólogo al sistema 1-F system encontrado en Yersinia pestis. Además, igual que el sistema bacteriano CRISPR/Cas el sistema ICP1 CRISPR/Cas puede adquirir nuevas secuencias, lo cual permite al fago co-evolucionar con su hospedador.[137]
Automatización y soporte de librerías
Existe un software gratuito para diseñar ARN y poder identificar cualquier gen deseado. El repositorio de Addgene ofrece a los académicos la posibilidad de crear su propio sistema ”CRISPR system" por 65 dólares. En 2013 Addgene distribuyó más de 10 000 constructos de CRISPR. La asociación ha recibido secuencias génicas activadoras de CRISPR de 11 equipos de investigación independientes.[22]
Propiedad intelectual
Hasta diciembre de 2014, los derechos sobre la patente de CRISPR estuvieron impugnados.[138]
El 12 de mayo de 2012 fue solicitada por el equipo de Doudna una aplicación de patente provisional sobre el uso del sistema CRISPR para la edición de genes y regulación de expresión génica. Fueron combinadas el 6 de marzo de 2014 aplicaciones subsecuentes. Los resultados fueron publicados por la oficina de patentes estadounidense (USPTO).[139] Los derechos de patente fueron asignados por los inventores a los regentes de la Universidad de California y la Universidad de Viena.
Por su parte, Feng Zhang en el Broad Institute, que había desarrollado y demostrado la tecnología CRISPR en células humanas, ha obtenido una patente de CRISPR para células con núcleo: células de animales (incluidos los humanos) y de plantas. Según Zhang, las predicciones formuladas por Doudna en su propia aplicación de patente de que su descubrimiento podría funcionar en humanos fueron una "mera conjetura", mientras que él fue el primero en demostrarlo en un acto de invención separado y "sorprendente".[140] Esta segunda patente es controvertida, ya que otros científicos sugieren que, en términos de propiedad intelectual, era evidente que la tecnología CRISPR funcionaría en células humanas y por tanto la invención de Zhang no sería merecedora de una patente propia.[140] Desde diciembre de 2014 se espera que Doudna y Charpentier planteen su oposición contra la patente del Broad Institute.
En febrero de 2017, la Oficina de Patentes de los Estados Unidos se pronunció sobre un caso de interferencia de patente presentado por la Universidad de California con respecto a las patentes emitidas al Broad Institute, y encontró que las patentes Broad, con reivindicaciones que abarcaban la aplicación de CRISPR/cas9 en células eucariotas, eran distintas de los inventos reclamados por la Universidad de California.[141][142][143]
Hasta noviembre de 2013, SAGE Labs (ahora parte del grupo Horizon Discovery) tenía derechos exclusivos de una de esas empresas para producir y vender ratas genéticamente modificadas y derechos no exclusivos para modelos de ratones y conejos.[144] En 2015, Thermo Fisher Scientific había autorizado la propiedad intelectual de ToolGen para desarrollar kits de reactivos CRISPR.[145]
Hay que aclarar que el sistema CRISPR fue descubierto por primera vez, por un grupo de científicos japoneses en 1987 liderado por Yoshizumi Ishino,[11][12] años después fue encontrado de nuevo de forma independiente por el microbiólogo alicantino Francis Mojica, actual profesor titular de la Universidad de Alicante.[146][147]
Cortadores alternativos
- CRISPR-DR2: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01315.
- CRISPR-DR5: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF011318.
- CRISPR-DR6: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01319.
- CRISPR-DR8: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01321.
- CRISPR-DR9: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01322.
- CRISPR-DR19: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01332.
- CRISPR-DR41: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01350.
- CRISPR-DR52: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01365.
- CRISPR-DR57: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01370.
- CRISPR-DR65: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01378.
Riesgos
Según investigadores del Instituto Wellcome Sanger en Inglaterra, la edición genética puede llevar a mutaciones no directamente relacionadas con el sitio de edición del genoma. La complejidad y la interrelación entre genes editados y no editados podría afectar a la salud de personas con genes editados.[148] Estas mutaciones, al ser genéticas, pueden ser transmitidas a la descendencia. En su monografía El fenotipo revolucionario (The revolutionary phenotype), el neurólogo canadiense Jean-François Gariépy desarrolla una teoría basada en la Hipótesis del mundo de ARN en que la edición del genoma humano podría llegar a un reemplazo de la reproducción biológica. En lugar de la presente reproducción biológica, podría formarse una reproducción controlada por científicos usando programas informáticos para cumplir los deseos de los padres eligiendo una edición genética para sus hijos.[149]
Véase también
- Edición génica CRISPR
- Nucleasas con dedos de zinc
- ADN no codificante
- CRISPR/Cpf1
- Edición de calidad
- Cas9
- Motivo adyacente de protoespaciador
Referencias
- ↑ a b c Horvath, P.; Barrangou, R. (2010). «CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea». Science 327 (5962): 167-170. PMID 20056882. doi:10.1126/science.1179555.
- ↑ «Flores, J. (2016, enero 5). Los orígenes bacterianos de la edición del genoma. La Jornada, sección Ciencias, p. 3a, suplemento La Jornada de enmedio. México: DEMOS. (Consultado 6 de enero del 2016)». Consultado el 5 de abril de 2017.
- ↑ a b c Marraffini LA, Sontheimer EJ (March 2010). «CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea». Nature Reviews Genetics 11 (3): 181-190. PMC 2928866. PMID 20125085. doi:10.1038/nrg2749.
- ↑ CRISPRdb 71/79 Archaea, 463/1008 Bacteria Archivado el 16 de mayo de 2015 en Wayback Machine., Date: 19.6.2010
- ↑ a b Grissa, I.; Vergnaud, G.; Pourcel, C (2007). «The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats». BMC Bioinformatics 8: 172. PMC 1892036. PMID 17521438. doi:10.1186/1471-2105-8-172.
- ↑ Barrangou, R.; Fremaux, C.; Deveau, H.; Richards, M.; Boyaval, P.; Moineau, S.; Romero, D. A.; Horvath, P. (2007). «CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes». Science 315 (5819): 1709-1712. PMID 17379808. doi:10.1126/science.1138140.
- ↑ a b Marraffini LA, Sontheimer EJ. (2008). «CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.». Science 322 (5909): 1843-5. PMID 19095942.
- ↑ Mali P, Esvelt KM, Church GM (2013). «Cas9 as a versatile tool for engineering biology». Nature methods 10 (10957-63). PMID 24076990.
- ↑ Kevin M Esvelt, Andrea L Smidler, Flaminia Catteruccia, George M Church (2014). «Concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations». eLife. doi:10.7554/eLife.03401.
- ↑ Overballe-Petersen S, Harms K, Orlando LA, Mayar JV, Rasmussen S, Dahl TW, Rosing MT, Poole AM, Sicheritz-Ponten T, Brunak S, Inselmann S, de Vries J, Wackernagel W, Pybus OG, Nielsen R, Johnsen PJ, Nielsen KM, Willerslev E. (2013). «Bacterial natural transformation by highly fragmented and damaged DNA». Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (49): 19860-5.
- ↑ a b http://jb.asm.org/content/169/12/5429.long Nucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product
- ↑ a b c Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. (1987). «Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.». J Bacteriol. 169 (12): 5429-33.
- ↑ Mojica, F. J.; Juez, G.; Rodríguez-Valera, F. (1 de agosto de 1993). «Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites». Molecular Microbiology 9 (3): 613-621. ISSN 0950-382X. PMID 8412707. Consultado el 20 de enero de 2016.
- ↑ Hermans, P. W.; van Soolingen, D.; Bik, E. M.; de Haas, P. E.; Dale, J. W.; van Embden, J. D. (1 de agosto de 1991). «Insertion element IS987 from Mycobacterium bovis BCG is located in a hot-spot integration region for insertion elements in Mycobacterium tuberculosis complex strains». Infection and Immunity 59 (8): 2695-2705. ISSN 0019-9567. PMC 258075. PMID 1649798. Consultado el 20 de enero de 2016.
- ↑ Groenen, P. M.; Bunschoten, A. E.; van Soolingen, D.; van Embden, J. D. (1 de diciembre de 1993). «Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacterium tuberculosis; application for strain differentiation by a novel typing method». Molecular Microbiology 10 (5): 1057-1065. ISSN 0950-382X. PMID 7934856. Consultado el 20 de enero de 2016.
- ↑ Mojica, F. J.; Ferrer, C.; Juez, G.; Rodríguez-Valera, F. (1 de julio de 1995). «Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning». Molecular Microbiology 17 (1): 85-93. ISSN 0950-382X. PMID 7476211. Consultado el 20 de enero de 2016.
- ↑ Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G. (2000). «Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria». Mol Microbiol 36 (1): 244-6. PMID 10760181.
- ↑ a b Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM (2002). «Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes». Mol Microbiol 43 (6): 1565-75.
- ↑ a b c d Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. (2005). «CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies». Microbiology 151 (Pt 3): 653-63.
- ↑ a b c Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD (2005). «Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin». Microbiology 151 (Pt 8): 2551-61.
- ↑ a b Mojica, Francisco J. M.; Díez-Villaseñor, César; García-Martínez, Jesús; Soria, Elena (1 de febrero de 2005). «Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements». Journal of Molecular Evolution 60 (2): 174-182. ISSN 0022-2844. PMID 15791728. doi:10.1007/s00239-004-0046-3. Consultado el 20 de enero de 2016.
- ↑ a b c d e f g h i j k Pennisi E (2013). «The CRISPR craze». Science 341 (6148): 833-6.
- ↑ a b Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (2012). «A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity». Science 337 (6096): 816-21.
- ↑ «CRISPR gene therapy: Scientists call for more public debate around breakthrough technique - Science - News"». The Independent. 7 de noviembre de 2013.
- ↑ DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM (2013). «Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems». Nucleic Acids Res 41 (7): 4336-43.
- ↑ Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JR, Joung JK (2013). «Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system». Nat Biotechnol 31 (3): 227-9.
- ↑ Gratz SJ, Cummings AM, Nguyen JN, Hamm DC, Donohue LK, Harrison MM, Wildonger J, O'Connor-Giles KM (2013). «Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease». Genetics 194 (4): 1029-35.
- ↑ Friedland AE, Tzur YB, Esvelt KM, Colaiácovo MP, Church GM, Calarco JA (2013). «Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system». Nat Methods 10 (8): 741-3.
- ↑ Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm M, Yang B, Weeks DP (2013). «Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice». Nucleic Acids Res 41 (20): e188.
- ↑ a b Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R (2013). «One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering». Cell 153 (4): 910-8.
- ↑ Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS (2013). «CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression». Nat Protoc 8 (11): 2180-96.
- ↑ «Researchers reverse a liver disorder in mice by correcting a mutated gene». PhysOrg. 30 de marzo de 2014. Consultado el 31 de marzo de 2014.
- ↑ Zetsche B; Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F (October 2015). «Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system». Cell 163 (3): 759-71. PMID 26422227. doi:10.1016/j.cell.2015.09.038.
- ↑ Fonfara I; Richter H, Bratovič M, Le Rhun A, Charpentier E (April 2016). «The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA». Nature 532 (7600): 517-21. PMID 27096362. doi:10.1038/nature17945.
- ↑ Ewen-Campen, B.; Perrimon, N. (2020). Expanding the horizons of genome editing in the fruit fly with Cas12a 117 (39). pp. 24019-24021. doi:10.1073/pnas.2016446117. Consultado el 18 de enero de 2021.
- ↑ Pausch, P.; Al-Shayeb, B.; Bisom-Rapp, E.; Tsuchida, C. A.; Li, Z.; Cress, B. F.; ...; Doudna, J. A. (2020). CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor 369 (6501). pp. 333-337. doi:10.1126/science.abb1400. Consultado el 25 de enero de 2021.
- ↑ Bosh, J. A.; Birchak, G.; Perrimon, N. (2020). Precise genome engineering in Drosophila using prime editing 118 (1). doi:10.1073/pnas.2021996118. Consultado el 25 de enero de 2021.
- ↑ a b c Young, Susan (11 de febrero de 2014). «CRISPR and Other Genome Editing Tools Boost Medical Research and Gene Therapy’s Reach | MIT Technology Review». Technologyreview.com. Archivado desde el original el 12 de enero de 2016. Consultado el 13 de abril de 2014.
- ↑ Shipman & al., Seth L. (12 de julio de 20147). «CRISPR–Cas encoding of a digital movie into the genomes of a population of living bacteria». Nature. Consultado el 16 de julio de 2017.
- ↑ a b c Haft DH, Selengut J, Mongodin EF, Nelson KE (2005). «A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes». PLoS Comput Biol 1 (6): e60.
- ↑ Stern A, Keren L, Wurtzel O, Amitai G, Sorek R (2010). «Self-targeting by CRISPR: gene regulation or autoimmunity?». Trends Genet 26 (8): 335-40.
- ↑ a b c Tyson, Gene W.; Banfield, Jillian F. (1 de enero de 2008). «Rapidly evolving CRISPRs implicated in acquired resistance of microorganisms to viruses». Environmental Microbiology 10 (1): 200-207. ISSN 1462-2920. PMID 17894817. doi:10.1111/j.1462-2920.2007.01444.x. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ a b c Chylinski K, Makarova KS, Charpentier E, Koonin EV (2014). «Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems». Nucleic Acids Res 42 (10): 6091-105.
- ↑ a b c Wiedenheft, B; Sternberg, SH; Doudna, JA (15 de febrero de 2012). «RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.». Nature 482 (7385): 331-8. PMID 22337052.
- ↑ Sinkunas T, Gasiunas G, Fremaux C, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V (2011). «Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system». EMBO J 30 (7): 1335-42.
- ↑ a b c d Aliyari R, Ding SW (2009). «RNA-based viral immunity initiated by the Dicer family of host immune receptors». Immunol Rev 227 (1): 176-88.
- ↑ a b Makarova KS, Aravind L, Wolf YI, Koonin EV (2011). Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems 6. p. 38.
- ↑ a b c d Gasiunas, Giedrius; Barrangou, Rodolphe; Horvath, Philippe; Siksnys, Virginijus (25 de septiembre de 2012). «Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109 (39): E2579-2586. ISSN 1091-6490. PMC 3465414. PMID 22949671. doi:10.1073/pnas.1208507109. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Chylinski K, Le Rhun A, Charpentier E (2013). «The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems». RNA Biol 10 (5): 726-37.
- ↑ a b Dugar, Gaurav; Herbig, Alexander; Förstner, Konrad U.; Heidrich, Nadja; Reinhardt, Richard; Nieselt, Kay; Sharma, Cynthia M. (1 de mayo de 2013). «High-resolution transcriptome maps reveal strain-specific regulatory features of multiple Campylobacter jejuni isolates». PLoS genetics 9 (5): e1003495. ISSN 1553-7404. PMC 3656092. PMID 23696746. doi:10.1371/journal.pgen.1003495. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Hatoum-Aslan, Asma; Maniv, Inbal; Marraffini, Luciano A. (27 de diciembre de 2011). «Mature clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats RNA (crRNA) length is measured by a ruler mechanism anchored at the precursor processing site». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 (52): 21218-21222. ISSN 1091-6490. PMC 3248500. PMID 22160698. doi:10.1073/pnas.1112832108. Consultado el 20 de mayo de 2016.
- ↑ a b Yosef, Ido; Goren, Moran G.; Qimron, Udi (1 de julio de 2012). «Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in Escherichia coli». Nucleic Acids Research 40 (12): 5569-5576. ISSN 1362-4962. PMC 3384332. PMID 22402487. doi:10.1093/nar/gks216. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ a b c d Swarts, Daan C.; Mosterd, Cas; van Passel, Mark W. J.; Brouns, Stan J. J. (1 de enero de 2012). «CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition». PloS One 7 (4): e35888. ISSN 1932-6203. PMC 3338789. PMID 22558257. doi:10.1371/journal.pone.0035888. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Babu, Mohan; Beloglazova, Natalia; Flick, Robert; Graham, Chris; Skarina, Tatiana; Nocek, Boguslaw; Gagarinova, Alla; Pogoutse, Oxana et al. (1 de enero de 2011). «A dual function of the CRISPR-Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair». Molecular Microbiology 79 (2): 484-502. ISSN 1365-2958. PMC 3071548. PMID 21219465. doi:10.1111/j.1365-2958.2010.07465.x. Consultado el 20 de mayo de 2016. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda)Babu, Mohan; Beloglazova, Natalia; Flick, Robert; Graham, Chris; Skarina, Tatiana; Nocek, Boguslaw; Gagarinova, Alla; Pogoutse, Oxana et al. (1 de enero de 2011). «A dual function of the CRISPR-Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair». Molecular Microbiology 79 (2): 484-502. ISSN 1365-2958. PMC 3071548. PMID 21219465. doi:10.1111/j.1365-2958.2010.07465.x. Consultado el 20 de mayo de 2016. Se sugiere usar|número-autores=
(ayuda) - ↑ Han, Dong; Lehmann, Kathleen; Krauss, Gerhard (18 de junio de 2009). «SSO1450--a CAS1 protein from Sulfolobus solfataricus P2 with high affinity for RNA and DNA». FEBS letters 583 (12): 1928-1932. ISSN 1873-3468. PMID 19427858. doi:10.1016/j.febslet.2009.04.047. Consultado el 20 de mayo de 2016.
- ↑ Wiedenheft, Blake; Zhou, Kaihong; Jinek, Martin; Coyle, Scott M.; Ma, Wendy; Doudna, Jennifer A. (10 de junio de 2009). «Structural basis for DNase activity of a conserved protein implicated in CRISPR-mediated genome defense». Structure (London, England: 1993) 17 (6): 904-912. ISSN 1878-4186. PMID 19523907. doi:10.1016/j.str.2009.03.019. Consultado el 20 de mayo de 2016.
- ↑ Beloglazova, Natalia; Brown, Greg; Zimmerman, Matthew D.; Proudfoot, Michael; Makarova, Kira S.; Kudritska, Marina; Kochinyan, Samvel; Wang, Shuren et al. (18 de julio de 2008). «A novel family of sequence-specific endoribonucleases associated with the clustered regularly interspaced short palindromic repeats». The Journal of Biological Chemistry 283 (29): 20361-20371. ISSN 0021-9258. PMC 2459268. PMID 18482976. doi:10.1074/jbc.M803225200. Consultado el 20 de mayo de 2016. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda) - ↑ Samai, Poulami; Smith, Paul; Shuman, Stewart (1 de diciembre de 2010). «Structure of a CRISPR-associated protein Cas2 from Desulfovibrio vulgaris». Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology and Crystallization Communications 66 (Pt 12): 1552-1556. ISSN 1744-3091. PMC 2998353. PMID 21139194. doi:10.1107/S1744309110039801. Consultado el 20 de mayo de 2016.
- ↑ Nam, Ki Hyun; Ding, Fran; Haitjema, Charles; Huang, Qingqiu; DeLisa, Matthew P.; Ke, Ailong (19 de octubre de 2012). «Double-stranded endonuclease activity in Bacillus halodurans clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated Cas2 protein». The Journal of Biological Chemistry 287 (43): 35943-35952. ISSN 1083-351X. PMC 3476262. PMID 22942283. doi:10.1074/jbc.M112.382598. Consultado el 20 de mayo de 2016.
- ↑ a b Mojica, F. J. M.; Díez-Villaseñor, C.; García-Martínez, J.; Almendros, C. (1 de marzo de 2009). «Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system». Microbiology (Reading, England) 155 (Pt 3): 733-740. ISSN 1350-0872. PMID 19246744. doi:10.1099/mic.0.023960-0. Consultado el 20 de enero de 2016.
- ↑ a b c d Horvath, Philippe; Romero, Dennis A.; Coûté-Monvoisin, Anne-Claire; Richards, Melissa; Deveau, Hélène; Moineau, Sylvain; Boyaval, Patrick; Fremaux, Christophe et al. (1 de febrero de 2008). «Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus». Journal of Bacteriology 190 (4): 1401-1412. ISSN 1098-5530. PMC 2238196. PMID 18065539. doi:10.1128/JB.01415-07. Consultado el 8 de agosto de 2016. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda) - ↑ a b c Deveau, Hélène; Barrangou, Rodolphe; Garneau, Josiane E.; Labonté, Jessica; Fremaux, Christophe; Boyaval, Patrick; Romero, Dennis A.; Horvath, Philippe et al. (1 de febrero de 2008). «Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus». Journal of Bacteriology 190 (4): 1390-1400. ISSN 1098-5530. PMC 2238228. PMID 18065545. doi:10.1128/JB.01412-07. Consultado el 8 de agosto de 2016. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda) - ↑ a b Lillestøl, Reidun K.; Shah, Shiraz A.; Brügger, Kim; Redder, Peter; Phan, Hien; Christiansen, Jan; Garrett, Roger A. (1 de abril de 2009). «CRISPR families of the crenarchaeal genus Sulfolobus: bidirectional transcription and dynamic properties». Molecular Microbiology 72 (1): 259-272. ISSN 1365-2958. PMID 19239620. doi:10.1111/j.1365-2958.2009.06641.x. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ a b Shah SA, Hansen NR, Garrett RA (2009). «Distribution of CRISPR spacer matches in viruses and plasmids of crenarchaeal acidothermophiles and implications for their inhibitory mechanism». Biochem Soc Trans 37 (Pt 1): 23-8.
- ↑ a b Díez-Villaseñor, César; Guzmán, Noemí M.; Almendros, Cristóbal; García-Martínez, Jesús; Mojica, Francisco J. M. (1 de mayo de 2013). «CRISPR-spacer integration reporter plasmids reveal distinct genuine acquisition specificities among CRISPR-Cas I-E variants of Escherichia coli». RNA biology 10 (5): 792-802. ISSN 1555-8584. PMC 3737337. PMID 23445770. doi:10.4161/rna.24023. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ a b c Erdmann, Susanne; Garrett, Roger A. (1 de septiembre de 2012). «Selective and hyperactive uptake of foreign DNA by adaptive immune systems of an archaeon via two distinct mechanisms». Molecular Microbiology 85 (6): 1044-1056. ISSN 1365-2958. PMC 3468723. PMID 22834906. doi:10.1111/j.1365-2958.2012.08171.x. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ a b Shah, Shiraz A.; Erdmann, Susanne; Mojica, Francisco J. M.; Garrett, Roger A. (1 de mayo de 2013). «Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity». RNA biology 10 (5): 891-899. ISSN 1555-8584. PMC 3737346. PMID 23403393. doi:10.4161/rna.23764. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Andersson, Anders F.; Banfield, Jillian F. (23 de mayo de 2008). «Virus population dynamics and acquired virus resistance in natural microbial communities». Science (New York, N.Y.) 320 (5879): 1047-1050. ISSN 1095-9203. PMID 18497291. doi:10.1126/science.1157358. Consultado el 20 de mayo de 2016.
- ↑ a b c d Pride, David T.; Sun, Christine L.; Salzman, Julia; Rao, Nitya; Loomer, Peter; Armitage, Gary C.; Banfield, Jillian F.; Relman, David A. (1 de enero de 2011). «Analysis of streptococcal CRISPRs from human saliva reveals substantial sequence diversity within and between subjects over time». Genome Research 21 (1): 126-136. ISSN 1549-5469. PMC 3012920. PMID 21149389. doi:10.1101/gr.111732.110. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ a b Goren, Moran G.; Yosef, Ido; Auster, Oren; Qimron, Udi (12 de octubre de 2012). «Experimental definition of a clustered regularly interspaced short palindromic duplicon in Escherichia coli». Journal of Molecular Biology 423 (1): 14-16. ISSN 1089-8638. PMID 22771574. doi:10.1016/j.jmb.2012.06.037. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ a b c Datsenko, Kirill A.; Pougach, Ksenia; Tikhonov, Anton; Wanner, Barry L.; Severinov, Konstantin; Semenova, Ekaterina (1 de enero de 2012). «Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system». Nature Communications 3: 945. ISSN 2041-1723. PMID 22781758. doi:10.1038/ncomms1937. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Tang, TH; Bachellerie, JP; Rozhdestvensky, T; Bortolin, ML; Huber, H; Drungowski, M; Elge, T; Brosius, J et al. (28 de mayo de 2002). «Identification of 86 candidates for small non-messenger RNAs from the archaeon Archaeoglobus fulgidus.». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99 (11): 7536-41. PMID 12032318. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda) - ↑ Tang, TH; Polacek, N; Zywicki, M; Huber, H; Brugger, K; Garrett, R; Bachellerie, JP; Hüttenhofer, A (de enero de 2005). «Identification of novel non-coding RNAs as potential antisense regulators in the archaeon Sulfolobus solfataricus.». Molecular microbiology 55 (2): 469-81. PMID 15659164.
- ↑ Gesner, EM; Schellenberg, MJ; Garside, EL; George, MM; Macmillan, AM (de junio de 2011). «Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway.». Nature structural & molecular biology 18 (6): 688-92. PMID 21572444.
- ↑ Sashital, DG; Jinek, M; Doudna, JA (de junio de 2011). «An RNA-induced conformational change required for CRISPR RNA cleavage by the endoribonuclease Cse3.». Nature structural & molecular biology 18 (6): 680-7. PMID 21572442.
- ↑ Haurwitz, RE; Jinek, M; Wiedenheft, B; Zhou, K; Doudna, JA (10 de septiembre de 2010). «Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.». Science (New York, N.Y.) 329 (5997): 1355-8. PMID 20829488.
- ↑ a b c Kunin, Victor; Sorek, Rotem; Hugenholtz, Philip (1 de enero de 2007). «Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats». Genome Biology 8 (4): R61. ISSN 1474-760X. PMC 1896005. PMID 17442114. doi:10.1186/gb-2007-8-4-r61. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Carte, J; Wang, R; Li, H; Terns, RM; Terns, MP (15 de diciembre de 2008). «Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes.». Genes & development 22 (24): 3489-96. PMID 19141480.
- ↑ Wang, R; Preamplume, G; Terns, MP; Terns, RM; Li, H (9 de febrero de 2011). «Interaction of the Cas6 riboendonuclease with CRISPR RNAs: recognition and cleavage.». Structure (London, England : 1993) 19 (2): 257-64. PMID 21300293.
- ↑ Niewoehner, O; Jinek, M; Doudna, JA (de enero de 2014). «Evolution of CRISPR RNA recognition and processing by Cas6 endonucleases.». Nucleic acids research 42 (2): 1341-53. PMID 24150936.
- ↑ Garneau, JE; Dupuis, MÈ; Villion, M; Romero, DA; Barrangou, R; Boyaval, P; Fremaux, C; Horvath, P; Magadán, AH; Moineau, S (4 de noviembre de 2010). «The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.». Nature 468 (7320): 67-71. PMID 21048762.
- ↑ Semenova, E; Jore, MM; Datsenko, KA; Semenova, A; Westra, ER; Wanner, B; van der Oost, J; Brouns, SJ et al. (21 de junio de 2011). «Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence.». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 (25): 10098-103. PMID 21646539. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda) - ↑ Gudbergsdottir, S; Deng, L; Chen, Z; Jensen, JV; Jensen, LR; She, Q; Garrett, RA (de enero de 2011). «Dynamic properties of the Sulfolobus CRISPR/Cas and CRISPR/Cmr systems when challenged with vector-borne viral and plasmid genes and protospacers.». Molecular microbiology 79 (1): 35-49. PMID 21166892.
- ↑ Manica, A; Zebec, Z; Teichmann, D; Schleper, C (de abril de 2011). «In vivo activity of CRISPR-mediated virus defence in a hyperthermophilic archaeon.». Molecular microbiology 80 (2): 481-91. PMID 21385233.
- ↑ Jore, MM; Lundgren, M; van Duijn, E; Bultema, JB; Westra, ER; Waghmare, SP; Wiedenheft, B; Pul, U; Wurm, R; Wagner, R; Beijer, MR; Barendregt, A; Zhou, K; Snijders, AP; Dickman, MJ; Doudna, JA; Boekema, EJ; Heck, AJ; van der Oost, J; Brouns, SJ (de mayo de 2011). «Structural basis for CRISPR RNA-guided DNA recognition by Cascade.». Nature structural & molecular biology 18 (5): 529-36. PMID 21460843.
- ↑ Wiedenheft, B; Lander, GC; Zhou, K; Jore, MM; Brouns, SJ; van der Oost, J; Doudna, JA; Nogales, E (21 de septiembre de 2011). «Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system.». Nature 477 (7365): 486-9. PMID 21938068.
- ↑ Zhang, J; Rouillon, C; Kerou, M; Reeks, J; Brugger, K; Graham, S; Reimann, J; Cannone, G; Liu, H; Albers, SV; Naismith, JH; Spagnolo, L; White, MF (10 de febrero de 2012). «Structure and mechanism of the CMR complex for CRISPR-mediated antiviral immunity.». Molecular cell 45 (3): 303-13. PMID 22227115.
- ↑ a b Hale, Caryn R.; Zhao, Peng; Olson, Sara; Duff, Michael O.; Graveley, Brenton R.; Wells, Lance; Terns, Rebecca M.; Terns, Michael P. (25 de noviembre de 2009). «RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex». Cell 139 (5): 945-956. ISSN 1097-4172. PMC 2951265. PMID 19945378. doi:10.1016/j.cell.2009.07.040. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Deng, Ling; Garrett, Roger A.; Shah, Shiraz A.; Peng, Xu; She, Qunxin (1 de marzo de 2013). «A novel interference mechanism by a type IIIB CRISPR-Cmr module in Sulfolobus». Molecular Microbiology 87 (5): 1088-1099. ISSN 1365-2958. PMID 23320564. doi:10.1111/mmi.12152. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ a b c Marraffini, Luciano A.; Sontheimer, Erik J. (28 de enero de 2010). «Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity». Nature 463 (7280): 568-571. ISSN 1476-4687. PMC 2813891. PMID 20072129. doi:10.1038/nature08703. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Kellie, Shaefer (29 de mayo de 2017). «Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo». Nature Methods. Consultado el 30 de julio de 2017.
- ↑ Derek, Lowe (31 de mayo de 2017). «Trouble with CRISPR? Maybe, But Maybe Not». Science. Archivado desde el original el 29 de julio de 2017. Consultado el 30 de julio de 2017.
- ↑ Whole-Genome Sequencing Analysis Reveals High Specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-Based Genome Editing in Human iPSCs.
- ↑ Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells.
- ↑ «Targeted and genome-wide sequencing reveal single nucleotide variations impacting specificity of Cas9 in human stem cells».
- ↑ Suh, Yousin (14 de diciembre de 2017). «Faculty of 1000 evaluation for CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets.». F1000 - Post-publication peer review of the biomedical literature. Consultado el 6 de enero de 2019.
- ↑ Joung, J. Keith; Maresca, Marcello; Aryee, Martin J.; Bohlooly-Y, Mohammad; Pinello, Luca; Mayr, Lorenz M.; Nitsch, Roberto; Nguyen, Nhu T. et al. (2018-09). «In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations». Nature (en inglés) 561 (7723): 416-419. ISSN 1476-4687. PMC 6194229. PMID 30209390. doi:10.1038/s41586-018-0500-9. Consultado el 6 de enero de 2019. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda) - ↑ Touchon, Marie; Rocha, Eduardo P. C. (1 de enero de 2010). «The small, slow and specialized CRISPR and anti-CRISPR of Escherichia and Salmonella». PloS One 5 (6): e11126. ISSN 1932-6203. PMC 2886076. PMID 20559554. doi:10.1371/journal.pone.0011126. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ a b c Rho, Mina; Wu, Yu-Wei; Tang, Haixu; Doak, Thomas G.; Ye, Yuzhen (1 de enero de 2012). «Diverse CRISPRs evolving in human microbiomes». PLoS genetics 8 (6): e1002441. ISSN 1553-7404. PMC 3374615. PMID 22719260. doi:10.1371/journal.pgen.1002441. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ a b Sun, Christine L.; Barrangou, Rodolphe; Thomas, Brian C.; Horvath, Philippe; Fremaux, Christophe; Banfield, Jillian F. (1 de febrero de 2013). «Phage mutations in response to CRISPR diversification in a bacterial population». Environmental Microbiology 15 (2): 463-470. ISSN 1462-2920. PMID 23057534. doi:10.1111/j.1462-2920.2012.02879.x. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Kuno, Sotaro; Sako, Yoshihiko; Yoshida, Takashi (1 de mayo de 2014). «Diversification of CRISPR within coexisting genotypes in a natural population of the bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa». Microbiology (Reading, England) 160 (Pt 5): 903-916. ISSN 1465-2080. PMID 24586036. doi:10.1099/mic.0.073494-0. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Bland, Charles; Ramsey, Teresa L.; Sabree, Fareedah; Lowe, Micheal; Brown, Kyndall; Kyrpides, Nikos C.; Hugenholtz, Philip (1 de enero de 2007). «CRISPR recognition tool (CRT): a tool for automatic detection of clustered regularly interspaced palindromic repeats». BMC bioinformatics 8: 209. ISSN 1471-2105. PMC 1924867. PMID 17577412. doi:10.1186/1471-2105-8-209. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Edgar, Robert C. (1 de enero de 2007). «PILER-CR: fast and accurate identification of CRISPR repeats». BMC bioinformatics 8: 18. ISSN 1471-2105. PMC 1790904. PMID 17239253. doi:10.1186/1471-2105-8-18. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Grissa, Ibtissem; Vergnaud, Gilles; Pourcel, Christine (1 de julio de 2007). «CRISPRFinder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats». Nucleic Acids Research 35 (Web Server issue): W52-57. ISSN 1362-4962. PMC 1933234. PMID 17537822. doi:10.1093/nar/gkm360. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Pride, David T.; Salzman, Julia; Relman, David A. (1 de septiembre de 2012). «Comparisons of clustered regularly interspaced short palindromic repeats and viromes in human saliva reveal bacterial adaptations to salivary viruses». Environmental Microbiology 14 (9): 2564-2576. ISSN 1462-2920. PMC 3424356. PMID 22583485. doi:10.1111/j.1462-2920.2012.02775.x. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Held, Nicole L.; Herrera, Alfa; Whitaker, Rachel J. (1 de noviembre de 2013). «Reassortment of CRISPR repeat-spacer loci in Sulfolobus islandicus». Environmental Microbiology 15 (11): 3065-3076. ISSN 1462-2920. PMID 23701169. doi:10.1111/1462-2920.12146. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Held, Nicole L.; Herrera, Alfa; Cadillo-Quiroz, Hinsby; Whitaker, Rachel J. (1 de enero de 2010). «CRISPR associated diversity within a population of Sulfolobus islandicus». PloS One 5 (9). ISSN 1932-6203. PMC 2946923. PMID 20927396. doi:10.1371/journal.pone.0012988. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Skennerton, Connor T.; Imelfort, Michael; Tyson, Gene W. (1 de mayo de 2013). «Crass: identification and reconstruction of CRISPR from unassembled metagenomic data». Nucleic Acids Research 41 (10): e105. ISSN 1362-4962. PMC 3664793. PMID 23511966. doi:10.1093/nar/gkt183. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Koonin, Eugene V.; Wolf, Yuri I. (1 de enero de 2009). «Is evolution Darwinian or/and Lamarckian?». Biology Direct 4: 42. ISSN 1745-6150. PMC 2781790. PMID 19906303. doi:10.1186/1745-6150-4-42. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Heidelberg, John F.; Nelson, William C.; Schoenfeld, Thomas; Bhaya, Devaki (1 de enero de 2009). «Germ warfare in a microbial mat community: CRISPRs provide insights into the co-evolution of host and viral genomes». PloS One 4 (1): e4169. ISSN 1932-6203. PMC 2612747. PMID 19132092. doi:10.1371/journal.pone.0004169. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Sampson, Timothy R.; Saroj, Sunil D.; Llewellyn, Anna C.; Tzeng, Yih-Ling; Weiss, David S. (9 de mayo de 2013). «A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence». Nature 497 (7448): 254-257. ISSN 1476-4687. PMC 3651764. PMID 23584588. doi:10.1038/nature12048. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Hale, Caryn R.; Majumdar, Sonali; Elmore, Joshua; Pfister, Neil; Compton, Mark; Olson, Sara; Resch, Alissa M.; Glover, Claiborne V. C.; Graveley, Brenton R.; Terns, Rebecca M.; Terns, Michael P. (10 de febrero de 2012). «Essential features and rational design of CRISPR RNAs that function with the Cas RAMP module complex to cleave RNAs». Molecular Cell 45 (3): 292-302. ISSN 1097-4164. PMC 3278580. PMID 22227116. doi:10.1016/j.molcel.2011.10.023. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Sorek, Rotem; Kunin, Victor; Hugenholtz, Philip (1 de marzo de 2008). «CRISPR--a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea». Nature Reviews. Microbiology 6 (3): 181-186. ISSN 1740-1534. PMID 18157154. doi:10.1038/nrmicro1793. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Cong, Le; Ran, F. Ann; Cox, David; Lin, Shuailiang; Barretto, Robert; Habib, Naomi; Hsu, Patrick D.; Wu, Xuebing; Jiang, Wenyan; Marraffini, Luciano A.; Zhang, Feng (15 de febrero de 2013). «Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems». Science (New York, N.Y.) 339 (6121): 819-823. ISSN 1095-9203. PMC 3795411. PMID 23287718. doi:10.1126/science.1231143. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Mali, Prashant; Yang, Luhan; Esvelt, Kevin M.; Aach, John; Guell, Marc; DiCarlo, James E.; Norville, Julie E.; Church, George M. (15 de febrero de 2013). «RNA-guided human genome engineering via Cas9». Science (New York, N.Y.) 339 (6121): 823-826. ISSN 1095-9203. PMC 3712628. PMID 23287722. doi:10.1126/science.1232033. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Hou Z, Zhang Y, Propson N, Howden S, Chu L, Sontheimer E et al (2013). «Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110 (39): 15644. doi:10.1073/pnas.1313587110.
- ↑ a b Young, Susan. «Biotech Startup Editas Medicine Wants to Cure Grievous Genetic Diseases with New Genome Editing Technology | MIT Technology Review». Technologyreview.com. Archivado desde el original el 6 de octubre de 2015. Consultado el 30 de noviembre de 2013.
- ↑ «Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac».
- ↑ Eides, Rachel (12 de junio de 2020). «CRISPR Therapeutics and Vertex Announce New Clinical Data for Investigational Gene-Editing Therapy CTX001™ in Severe Hemoglobinopathies at the 25th Annual European Hematology Association (EHA) Congress». Consultado el 21 de junio de 2020.
- ↑ Silva, Joana Cavaco (13 de mayo de 2020). «CTX001». Consultado el 24 de junio de 2020.
- ↑ «Científicos chinos aseguran haber creado los primeros bebés modificados genéticamente». El Pais. noviembre de 2018.
- ↑ Arthur Caplan (30 de abril de 2019). «Getting serious about the challenge of regulating germline gene therapy». PLOS Biology 17 (4): e3000223. doi:10.1371/journal.pbio.3000223.
- ↑ Haoyi Wang; Hui Yang (30 de abril de 2019). «Gene-edited babies: What went wrong and what could go wrong». PLOS Biology 17 (4): e3000224. doi:10.1371/journal.pbio.3000224.
- ↑ Talbot, David (19 de julio de 2014). «Beijing Researchers Use Gene Editing to Create Disease-Resistant Wheat | MIT Technology Review». Technologyreview.com. Consultado el 23 de julio de 2014.
- ↑ Wang, Yanpeng (2014). «Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew». Nature Biotechnology. doi:10.1038/nbt.2969.
- ↑ Chang, Jiasong, et al. "Genome-wide CRISPR Screening Reveals Genes Essential for Cell Viability and Resistance to Abiotic and Biotic Stresses in Bombyx Mori." Genome Research, vol. 30, no. 5, 2020, pp. 757-767.
- ↑ ENCODE Project Consortium (6 de septiembre de 2012). «An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome». Nature 489 (7414): 57-74. ISSN 1476-4687. PMC 3439153. PMID 22955616. doi:10.1038/nature11247. Consultado el 18 de febrero de 2017.
- ↑ Melnikov, Alexandre; Murugan, Anand; Zhang, Xiaolan; Tesileanu, Tiberiu; Wang, Li; Rogov, Peter; Feizi, Soheil; Gnirke, Andreas et al.. «Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay». Nature Biotechnology 30 (3): 271-277. PMC 3297981. PMID 22371084. doi:10.1038/nbt.2137. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda) - ↑ «Targeting the Noncoding Genome with CRISPR». 29 de septiembre de 2016.
- ↑ Sanjana, Neville E.; Wright, Jason; Zheng, Kaijie; Shalem, Ophir; Fontanillas, Pierre; Joung, Julia; Cheng, Christine; Regev, Aviv et al. (30 de septiembre de 2016). «High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome». Science (en inglés) 353 (6307): 1545-1549. ISSN 0036-8075. PMC 5144102. PMID 27708104. doi:10.1126/science.aaf7613. Consultado el 18 de febrero de 2017. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda) - ↑ V600E
- ↑ Akbani, Rehan; Akdemir, Kadir C.; Aksoy, B. Arman; Albert, Monique; Ally, Adrian; Amin, Samirkumar B.; Arachchi, Harindra; Arora, Arshi et al.. «Genomic Classification of Cutaneous Melanoma». Cell 161 (7): 1681-1696. PMC 4580370. PMID 26091043. doi:10.1016/j.cell.2015.05.044. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda) - ↑ Sosman, Jeffrey A.; Kim, Kevin B.; Schuchter, Lynn; Gonzalez, Rene; Pavlick, Anna C.; Weber, Jeffrey S.; McArthur, Grant A.; Hutson, Thomas E. et al. (23 de febrero de 2012). «Survival in BRAF V600–Mutant Advanced Melanoma Treated with Vemurafenib». New England Journal of Medicine 366 (8): 707-714. ISSN 0028-4793. PMC 3724515. PMID 22356324. doi:10.1056/NEJMoa1112302. Consultado el 18 de febrero de 2017. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda) - ↑ Zubrilov, Inna; Sagi-Assif, Orit; Izraely, Sivan; Meshel, Tsipi; Ben-Menahem, Shlomit; Ginat, Ravit; Pasmanik-Chor, Metsada; Nahmias, Clara et al.. «Vemurafenib resistance selects for highly malignant brain and lung-metastasizing melanoma cells». Cancer Letters 361 (1): 86-96. doi:10.1016/j.canlet.2015.02.041. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda) - ↑ Shalem, Ophir; Sanjana, Neville E.; Hartenian, Ella; Shi, Xi; Scott, David A.; Mikkelsen, Tarjei S.; Heckl, Dirk; Ebert, Benjamin L. et al. (3 de enero de 2014). «Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells». Science (en inglés) 343 (6166): 84-87. ISSN 0036-8075. PMC 4089965. PMID 24336571. doi:10.1126/science.1247005. Consultado el 18 de febrero de 2017. Se sugiere usar
|número-autores=
(ayuda) - ↑ Novick, Richard P.; Christie, Gail E.; Penadés, Jose R. (1 de agosto de 2010). «The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria». Nature Reviews. Microbiology 8 (8): 541-551. ISSN 1740-1534. PMC 3522866. PMID 20634809. doi:10.1038/nrmicro2393. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ Seed, Kimberley D.; Lazinski, David W.; Calderwood, Stephen B.; Camilli, Andrew (28 de febrero de 2013). «A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity». Nature 494 (7438): 489-491. ISSN 1476-4687. PMC 3587790. PMID 23446421. doi:10.1038/nature11927. Consultado el 8 de agosto de 2016.
- ↑ «Who Owns the Biggest Biotech Discovery of the Century? There’s a bitter fight over the patents for CRISPR, a breakthrough new form of DNA editing.». MIT Technology Review. Archivado desde el original el 17 de noviembre de 2015. Consultado el 25 de febrero de 2015. «CRISPR Patents Spark Fight to Control Genome Editing».
- ↑ «Methods And Compositions For Rna-directed Target Dna Modification And For Rna-directed Modulation Of Transcription». Freshpatents.com. Archivado desde el original el 7 de abril de 2014. Consultado el 13 de abril de 2014.
- ↑ a b Who Owns the Biggest Biotech Discovery of the Century? Archivado el 17 de noviembre de 2015 en Wayback Machine. Antonio Regalado, Technology Review, 04 December 2014.
- ↑ Pollack, Andrew (15 de febrero de 2017). «Harvard and M.I.T. Scientists Win Gene-Editing Patent Fight». The New York Times.
- ↑ Akst, Jef (15 de febrero de 2017). «Broad Wins CRISPR Patent Interference Case». The Scientist Magazine.
- ↑ Noonan, Kevin E. (16 de febrero de 2017). «PTAB Decides CRISPR Interference in Favor of Broad Institute -- Their Reasoning». Patent Docs.
- ↑ «CRISPR Madness». GEN.
- ↑ Staff (1 de abril de 2015). «News: Products & Services». Genetic Engineering & Biotechnology News (Paper) 35 (7): 8.
- ↑ http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(15)01705-5 The Heroes of CRISPR
- ↑ «http://www.agenciasinc.es/Entrevistas/Estoy-viviendo-la-revolucion-CRISPR-con-agobio-y-felicidad». Consultado el 5 de abril de 2017.
- ↑ Alejandra Martins (2018). «CRISPR/Cas9: las serias advertencias de unos científicos sobre los peligros de la técnica que revolucionó la genética».
- ↑ Jean-François Gariépy (2018). The revolutionary phenotype (en inglés). p. 92–95. ISBN 9781729861561.
Datos: Q412563
Multimedia: CRISPR / Q412563